原創(chuàng) 楊青

隨著全球農(nóng)業(yè)集約化的發(fā)展和化學(xué)殺蟲劑的廣泛使用，農(nóng)業(yè)害蟲對(duì)殺蟲劑的抗性問題已成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要不利因素。近年來，農(nóng)業(yè)害蟲對(duì)化學(xué)殺蟲劑的抗性不斷增強(qiáng)，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)、生產(chǎn)成本上升、環(huán)境污染加劇等問題。

昆蟲ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已被證實(shí)與殺蟲劑抗性高度關(guān)聯(lián)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為殺蟲劑抗性形成過程中的關(guān)鍵角色，通過將外源性殺蟲劑底物排出胞外介導(dǎo)殺蟲劑抗性的形成。迄今為止，昆蟲ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已被證明與27種不同的殺蟲劑、殺螨劑的轉(zhuǎn)運(yùn)和抗性有關(guān)。昆蟲ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的種類多種多樣，可以分為ABCA-ABCH八個(gè)亞家族。其中，ABCC亞家族成員被頻繁報(bào)道與殺蟲劑的運(yùn)輸和抗性相關(guān)，在儲(chǔ)糧害蟲赤擬谷盜中，ABCC亞家族成員ABCC-9C（TcABC-9C）作為一種殺蟲劑抗性相關(guān)蛋白，已被報(bào)道與幾丁質(zhì)合成抑制劑除蟲脲（DFB）抗性相關(guān)。然而，迄今為止，關(guān)于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與殺蟲劑抗性關(guān)系的研究主要集中在遺傳證據(jù)以及相關(guān)基因或蛋白表達(dá)水平的量化上。這些證據(jù)包括昆蟲在殺蟲劑壓力下相關(guān)基因表達(dá)水平的變化，或基因沉默使昆蟲對(duì)殺蟲劑的敏感性改變等。然而，在蛋白水平上解釋ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與殺蟲劑底物的識(shí)別機(jī)制仍然鮮有報(bào)道。闡明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，對(duì)解決抗藥性問題、發(fā)展新型殺蟲劑或增效劑具有重要意義。

近期，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所楊青教授課題組，以赤擬谷盜ABCC亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白成員ABCC-9C為研究對(duì)象，建立了一種基于ATPase活力檢測(cè)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白殺蟲劑底物篩選方法，以及基于體外親和力檢測(cè)、細(xì)胞解毒實(shí)驗(yàn)、生物活性檢測(cè)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析的底物驗(yàn)證方法。這些實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合使用，可以高通量篩選ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白潛在的殺蟲劑底物，并全面評(píng)估ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)篩選出的殺蟲劑底物在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率及解毒能力。該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵部捎糜谄渌鸄BCC亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白潛在底物的篩選及預(yù)測(cè)ABCC亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的殺蟲劑抗性。

主要結(jié)果：

1. 基于ATPase活性檢測(cè)篩選TcABCC-9C潛在殺蟲劑底物

通過ATP酶活性檢測(cè)本研究篩選了19種常用殺蟲劑，發(fā)現(xiàn)克百威 (carbofuran) 、  噻嗪酮 (buprofezin) 、噻螨酮（Hexythiazox）和阿維菌素(Avermectin)顯著提高了TcABCC-9C的ATPase活性,表明它們可能是該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的潛在殺蟲劑底物。

2. 篩選到的殺蟲劑分子對(duì)TcABCC-9C具有顯著親和力

進(jìn)一步通過SPR實(shí)驗(yàn)（表面等離子體共振）分析了篩選到的殺蟲劑分子與TcABCC-9C的結(jié)合親和力。實(shí)驗(yàn)顯示，四種殺蟲劑與TcABCC-9C之間具有較強(qiáng)的體外結(jié)合能力。

3. 基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的解毒能力評(píng)估

本研究進(jìn)一步利用HEK293細(xì)胞評(píng)估了TcABCC-9C對(duì)以上四種殺蟲劑的解毒能力。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染TcABCC-9C的細(xì)胞對(duì)克百威和噻嗪酮具有明顯的解毒能力，這表明ABCC-9C可能通過外排殺蟲劑分子的方式參與克百威和噻嗪酮的解毒。

4. 基于RNA干擾的功能驗(yàn)證

利用克百威和噻嗪酮處理幼蟲后，TcABCC-9C的表達(dá)水平顯著提升；利用RNA干擾技術(shù)沉默TcABCC-9C后，赤擬谷盜幼蟲對(duì)克百威和噻嗪酮兩種殺蟲劑分子的敏感性顯著提升，這證實(shí)了TcABCC-9C在參與克百威和噻嗪酮轉(zhuǎn)運(yùn)和抗性發(fā)生中的潛在功能。

5. 結(jié)構(gòu)功能關(guān)系分析

利用AlphaFold結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，本研究獲得了TcABCC-9C三維結(jié)構(gòu)模型。結(jié)構(gòu)分析表明，ABCC-9C具有典型的ABCC亞家族蛋白結(jié)構(gòu)特征，其整體結(jié)構(gòu)包含兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）和兩個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）。TMD結(jié)構(gòu)域形成了一個(gè)兩親性底物結(jié)合通道。分子對(duì)接表明，ABCC-9C可以招募一個(gè)克百威或噻嗪酮分子到TMD結(jié)構(gòu)域形成的轉(zhuǎn)運(yùn)通道中，并且兩種殺蟲劑分子以相似的方式結(jié)合在TMD結(jié)構(gòu)域底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道的中心位置。

大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院博士研究生陳金利為該論文第一作者，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所楊青教授為通訊作者。博士研究生王棟、劉偉、周園園參與了本研究。本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金(32161133010)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2022YFD1700200)、深圳大鵬新區(qū)科技創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金(PT202101-02)和深圳市科技計(jì)劃(KQTD20180411143628272)的支持。

原文信息：

Chen, J. L., Wang, D., Liu, W., Zhou, Y. Y. and Yang, Q. (2024) Potential pesticide substrates of an insect ABCC transporter. Insect Science, DOI 10.1111/1744-7917.13476.